Нанотехнологичекий подход к определению модификации ДНК

 


Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности, оно заключается в обратимой химической модификации азотистого основания – цитозина (С) в результате переноса метильной группы на 5' позицию цитозина. Метилирование играет важную роль в процессах регуляции активности генов, дифференцировки, канцерогенеза и старения. Нарушение регуляции этого процесса является причиной и маркером раковых заболеваний.

В настоящее время методы выявления метилированных оснований ДНК имеют существенные недостатки. Метилчувствительная ПЦР (полимеразная цепная реакция – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале и широко используемый в медицинской практике) может оказаться недостаточно чувствительной для количественного определения малого числа метилированных оснований. Оптимизированный для детекции количества копий исследуемой ДНК метод ПЦР в реальном времени (real time ПЦР) требует проведения нескольких циклов и является дорогостоящим.

Новая система анализа делает ПЦР более чувствительной и эффективной. Работа, описывающая данную разработку, была представлена в сентябре на третьей международной конференции Американской Ассоциации по исследованию рака.

«Очень важно определять метилирование ДНК, поскольку было показано что именно с помощью этого механизма выключается большее количество генов, подавляющих развитие опухоли, чем за счет мутаций, – рассказывает автор разработки, Васудев Бэйли (Vasudev Bailey). – Предложенный нами метод скрининга для определения метилированной ДНК является простым, недорогим и ценным в решении задач ранней диагностики рака, наблюдения за поведением опухоли и контроля эффективности проводимой терапии.

Для того, чтобы протестировать возможности методики, Бэйли и его коллеги обработали участки ДНК бисульфатом натрия, в присутствии которого происходит превращение всех неметилированных цитозиновых оснований ДНК в урацилы (нуклеотидные основания, характерные для РНК), не затрагивая метилированные цитозиновые основания.

Затем с полученной ДНК ученые провели ПЦР, используя меченные биотином праймеры и получив в результате меченную биотином ДНК. Далее, добавив к белку стрептавидину квантовые точки (quantum dots) – нанометровые молекулы с электрическими свойствами и проведя реакцию сорбции биотин – стрептавидин, ученые получили возможность выделить комплекс quantum dots-стрептавидин-биотин-метилированная ДНК.

С помощью нового метода анализа можно определить менее 15 пикограммов метилированной ДНК в присутствии 10000 – кратного избытка неметилированной последовательности, и эта детекция становится возможна всего лишь в 8 циклах ПЦР, причем объем исходного образца в 50 раз меньше требуемого в используемых на настоящий момент методиках. Такая миниатюризация достигается с использованием созданной на основе описанного метода лабораторной чиповой системы, обеспечивающей минимальную пробоподготовку и одновременный скрининг множества образцов. Эта система уже патентуется учеными.

В серии других экспериментов ученые тестировали свою новую технологию, пытаясь точно определить метилирование гена ASC/TMS1, участвующего в апоптозе (запрограммированной клеточной смерти), в маленьких количествах ДНК из человеческой слюны. Задача была выполнена с меньшим количеством стадий и циклов ПЦР. Также успешно прошли тесты по количественному определению патологий метилирования в образцах костного мозга, до и после курса лечения пациентов.

Бэйли подчеркнул, что новая тест-система позволяет определять метилирование в множестве генов одновременно, а также одновременно видеть метилированную и неметилированную ДНК, и вычислять таким образом их соотношение.


Источник: NanoNewsNet