Оптическая микроскопия сверхвысокого разрешения позволяет видеть «трехмерные» изображения нанообъектов

 


Исследователи из Медицинского института Говарда Хьюза (США) сумели значительно усовершенствовать один из ведущих методов световой микроскопии, который позволяет определять положение флуоресцентных белков в клетках с точностью до 10–20 нм. Ученые создали новую технологию построения изображений, адаптировав принципы интерферометрии к существующей технологии. В результате получены «трехмерные» изображения клеточных структур, с разрешением, до сих пор не виданным в оптической микроскопии.

«Мы создали прекрасный инструмент для наблюдения за процессами, происходящими на клеточном уровне», – уверен д-р Харальд Хесс (Harald Hess, PhD) –директор департамента прикладной физики на исследовательском кампусе Janelia Farm Медицинского института Говарда Хьюза, возглавивший разработку микроскопов нового типа. Предложенная методика получила название iPALM – interferometric PhotoActivated Localization Microscopy, интерферометрическая светочувствительная локализационная микроскопия); основой для ее реализации послужила технология PALM, предложенная д-ром Хессом и его коллегой д-ром Эриком Бетцигом (Eric Betzig) в 2005 году.

Суть метода PALM состоит в том, что введенные в клетку флуоресцентные метки активируются (и деактивируются) постепенно, с помощью световых импульсов: на каждом из снимаемых изображений «включается» лишь малая их часть. При объединении нескольких тысяч таких изображений создается цельная иллюстрация всей исследуемой структуры, на которой отдельно отмечен каждый флуоресцентный белок. В результате ученые получают гораздо более четкую картину, чем в случае применения методов традиционной флуоресцентной микроскопии.

Совершенствованием методики PALM занимались оба ее изобретателя: д-р Бетциг пытался приспособить технологию для исследования живых клеток и флуоресцентных белков разного цвета свечения, а д-р Хесс собирался обеспечить получаемым изображениям дополнительное, третье, измерение. Довольно быстро д-р Хесс пришел к выводу о том, что лучшим способом определения глубины расположения белка в образце будет интерферометрия, и уже в сентябре 2006 года он предложил идею iPALM. «Интерферометрия — один из самых точных методов измерения, — объясняет ученый. — Если у вас есть источники света достаточной яркости, появляется возможность измерять сверхмалые величины».

Прежде исследователю приходилось использовать классические интерферометрические методы для классических же задач – поиска неровностей на поверхности пластин жесткого диска. Измерения проводились следующим образом: световая волна посылалась в сторону изучаемой поверхности, отражалась от нее и сравнивалась с «эталонной», отраженной от зеркала, которое устанавливалось на известном удалении от источника. При обнаружении малейшего отличия расстояния между пластиной и источником от заданного приемник фиксировал смещение фаз отраженных волн друг относительно друга. По измеренному значению амплитуды суммарной волны (в идеале оно должно быть нулевым) определялась высота неровности с точностью до нанометров.

Основная сложность применения указанной технологии для изучения биологических образцов состоит в том, что свет испускается не лазером, а флуоресцентными молекулами, находящимися внутри исследуемого объекта. Проблема получения «эталонной» волны была решена методом расщепления фотонов; каждый квант света, таким образом, служил образцом для самого себя. С помощью стандартного PALM-микроскопа частицы собирались с обеих сторон пробы, а затем два световых пучка посылались на светоделительный элемент, который расщеплял их и направлял к трем отдельным камерам. По результатам измерения интенсивности пучков, попавших в каждую из камер, делался вывод о глубине расположения метки в пробе.

По мнению д-ра Хесса для функционирования новой технологии достаточно лишь небольшого количества фотонов, что важно с практической стороны и существенно превосходит по эффективности существующие методики.


Источник: < a href="http://www.NanoNewsNet.ru" target="blank">NanoNewsNet