Нанотехнологичекий подход к определению модификации ДНК

 


Ученые из Университета Джона Хопкинса (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore) разработали новую методику для количественного определения природного химического модифицирования ДНК, известного как метилирование. Эта технология найдет применение в области ранней диагностики рака и контроля состояния пациента в процессе лечения.

Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности, оно заключается в обратимой химической модификации азотистого основания – цитозина (С) в результате переноса метильной группы на 5' позицию цитозина. Метилирование играет важную роль в процессах регуляции активности генов, дифференцировки, канцерогенеза и старения. Нарушение регуляции этого процесса является причиной и маркером раковых заболеваний.

В настоящее время методы выявления метилированных оснований ДНК имеют существенные недостатки. Метилчувствительная ПЦР (полимеразная цепная реакция – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале и широко используемый в медицинской практике) может оказаться недостаточно чувствительной для количественного определения малого числа метилированных оснований. Оптимизированный для детекции количества копий исследуемой ДНК метод ПЦР в реальном времени (real time ПЦР) требует проведения нескольких циклов и является дорогостоящим.

Новая система анализа делает ПЦР более чувствительной и эффективной. Работа, описывающая данную разработку, была представлена в сентябре на третьей международной конференции Американской Ассоциации по исследованию рака.

«Очень важно определять метилирование ДНК, поскольку было показано что именно с помощью этого механизма выключается большее количество генов, подавляющих развитие опухоли, чем за счет мутаций, – рассказывает автор разработки, Васудев Бэйли (Vasudev Bailey). – Предложенный нами метод скрининга для определения метилированной ДНК является простым, недорогим и ценным в решении задач ранней диагностики рака, наблюдения за поведением опухоли и контроля эффективности проводимой терапии.

Для того, чтобы протестировать возможности методики, Бэйли и его коллеги обработали участки ДНК бисульфатом натрия, в присутствии которого происходит превращение всех неметилированных цитозиновых оснований ДНК в урацилы (нуклеотидные основания, характерные для РНК), не затрагивая метилированные цитозиновые основания.

Затем с полученной ДНК ученые провели ПЦР, используя меченные биотином праймеры и получив в результате меченную биотином ДНК. Далее, добавив к белку стрептавидину квантовые точки (quantum dots) – нанометровые молекулы с электрическими свойствами и проведя реакцию сорбции биотин – стрептавидин, ученые получили возможность выделить комплекс quantum dots-стрептавидин-биотин-метилированная ДНК.

С помощью нового метода анализа можно определить менее 15 пикограммов метилированной ДНК в присутствии 10000 – кратного избытка неметилированной последовательности, и эта детекция становится возможна всего лишь в 8 циклах ПЦР, причем объем исходного образца в 50 раз меньше требуемого в используемых на настоящий момент методиках. Такая миниатюризация достигается с использованием созданной на основе описанного метода лабораторной чиповой системы, обеспечивающей минимальную пробоподготовку и одновременный скрининг множества образцов. Эта система уже патентуется учеными.

В серии других экспериментов ученые тестировали свою новую технологию, пытаясь точно определить метилирование гена ASC/TMS1, участвующего в апоптозе (запрограммированной клеточной смерти), в маленьких количествах ДНК из человеческой слюны. Задача была выполнена с меньшим количеством стадий и циклов ПЦР. Также успешно прошли тесты по количественному определению патологий метилирования в образцах костного мозга, до и после курса лечения пациентов.

Бэйли подчеркнул, что новая тест-система позволяет определять метилирование в множестве генов одновременно, а также одновременно видеть метилированную и неметилированную ДНК, и вычислять таким образом их соотношение.


Источник: NanoNewsNet