Нанотехнологии в тканевой инженерии

 


Создание костной ткани из собственных клеток пациента является важной задачей тканевой инженерии и представляет практический интерес для медицины и ветеринарии.

Основная идея генерации новой кости проста. Из биосовместимого материала делают заготовку, имеющую форму будущей кости. В систему вносят клетки-предшественники костной ткани, которые со временем должны заселить весь объем заготовки. Чтобы клетки росли и развивались, добавляют сигнальные молекулы, факторы дифференцировки и роста клеток кости. Если все условия подобраны правильно, со временем на месте заготовки образуется кость, по прочности и другим характеристикам очень похожая на настоящую (рисунок 1).

В качестве клеток-предшественников костной ткани используют мезенхимальные стволовые клетки (mesenchymal stem cells, MSC), которые находятся, например, в костном мозге каждого человека. Эти клетки в соответствующих условиях могут дифференцироваться в клетки разных типов: жировые, костные, хрящевые, мышцы, клетки соединительной ткани. Для правильного формирования кости необходимо, чтобы MSC дифференцировались в остеогенные клетки, которые в дальнейшем разовьются в зрелые клетки костной ткани – остеобласты и остеоциты.

Однако даже у такого замечательного подхода имеется ряд нерешенных проблем. Например, факторы, стимулирующие образование кости, для каждого пациента должны подбираться индивидуально, с учетом возраста, пола и т.п. Другая трудность заключается в том, что зачастую MSC формируют вокруг заготовки мягкие ткани, прежде чем успеют дифференцироваться в клетки кости и прорасти внутрь.

Группа ученых из Великобритании задумалась над тем, как заставить MSC дифференцироваться в клетки костной ткани без применения химических воздействий. Известно, что дифференцировка MSC in vitro зависит от особенностей подложки, на которой они растут, однако у разных исследователей получались противоречивые результаты. В целом считается, что более шероховатая подложка способствует лучшей дифференцировке клеток костной ткани, однако в некоторых случаях бывает и наоборот.

Британские ученые предположили, что все дело в наноразмерных особенностях шероховатой поверхности. Чтобы проверить свою догадку, они изготовили при помощи метода электронно-лучевой литографии (electron beam lithography, EBL) различные подложки из полиметилметакрилата (PMMA), на которых определенным образом располагались лунки 120 нм в диаметре и 100 нм глубиной. Расстояние между лунками составляло в среднем 300 нм. Помимо подложек с регулярным расположением лунок (в вершинах шестиугольника, HEX, или квадрата, SQ), были также исследованы поверхности с разной степенью разупорядоченности: лунки располагались в пределах 20 нм от вершин правильных квадратов (DSQ20), в пределах 50 нм (DSQ50) или же были нанесены случайным образом (RAND).

В первой серии экспериментов было изучено поведение человеческих остеогенных клеток на таких подложках in vitro. Чтобы оценить эффективность образования внеклеточного матрикса кости, препараты на 21-й день были обработаны антителами к остеопонтину и остеокальцину. Эти белки являются тканеспецифичными внеклеточными компонентами кости. Результат такого эксперимента представлен на рисунке 2. Как оказалось, на подложке с несколько разупорядоченным расположением лунок клетки достигают достаточной плотности и лучше всего синтезируют остеопонтин и остеокальцин. Более того, в этих препаратах было отмечено появление островков окостенения (bone nodule), что является важным этапом в процессе нормального формирования кости.

Однако гораздо интереснее знать, как поведут себя мезенхимальные стволовые клетки и будут ли они дифференцироваться в остеогенные клетки. Поэтому в следующей серии экспериментов исследователи изучили влияние наноструктурированных подложек на развитие MSC. Как и прежде, препараты окрашивали антителами к специфичным белкам внеклеточного матрикса кости (остеопонтину и остеокальцину); кроме того, их окрасили ализарином, чтобы проследить за минерализацией матрикса. Результаты представлены на рисунке 3. Снова оказалось, что наилучшее развитие костной ткани наблюдается на подложке с углублениями, расположенными в пределах 50 нм от вершин правильных квадратов.

Ученые не остановились на достигнутом. Для дальнейших исследований была выбрана подложка, показавшая наилучшие результаты в предыдущих опытах - DSQ50. Чтобы оценить, насколько полученные популяции клеток похожи на настоящую костную ткань, был изучен профиль экспрессии генов этих клеток. В качестве положительного контроля использовали клетки, выращенные на ровной подложке, однако обработанные индуктором формирования костной ткани – кортикостероидом дексаметазоном (DEX). Принято считать, что при обработке DEX клетки формируют костную ткань. В качестве отрицательного контроля взяли клетки, выращенные на ровной подложке без какой-либо дополнительной обработки. Оказалось, что профиль экспрессии генов довольно близок к положительному контролю, хотя в некоторых деталях и отличается от него. Однако по крайней мере часть отличий вызвана влиянием DEX на стероидные рецепторы и не связана с развитием костной ткани.

На основании проделанных экспериментов ученые заключают, что нашли способ выращивать клетки костной ткани без применения химических воздействий. Несомненно, это важный шаг в области тканевой инженерии кости.

Работа The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder" опубликована в "Nature Materials". doi:10.1038/nmat2013

Нанотехнологическое сообщество "Нанометр"